Родился 20 мая 1963 г. в Москве.
В 1985 г. окончил филологический факультет Московского государственного педагогического института им. В.И. Ленина (ныне Московский педагогический государственный университет) по специальности "учитель русского языка".
Кандидат политических наук. В 2001 г. защитил диссертацию на тему "Политологический анализ процесса становления федеративных отношений в России".
После окончания вуза работал диспетчером Московского городского бюро путешествий и экскурсий, затем, в 1987-1988 гг. - инженером в Центре содействия творческой инициативе "Сотрудничество".
С 1987 г. - участник неформального движения, член клуба "Перестройка", в 1988-1989 гг. - группы "Перестройка-88". Одновременно в 1988-1989 гг. вместе с Вячеславом Игруновым, Владимиром Прибыловским и др. занимался выпуском самиздатской газеты "Хронограф", был одним из ее авторов.
В это же время работал в научно-аналитическом центре кооператива "Перспектива" по изучению самиздата, оказанию содействия изданиям различных неформальных групп.
Вместе с Вячеславом Игруновым основал исследовательский центр "Московское общественное Бюро информационного обмена", на основе которого в 1990 г. был учрежден Институт гуманитарно-политических исследований (ИГПИ), который возглавил Игрунов. В 1990 г. Сергей Митрохин стал главным научным сотрудником, затем заместителем директора ИГПИ. В 1992 г. окончил Высшие социологические курсы, организованные Игруновым.
В 1993 г., накануне первых выборов в Госдуму, участвовал в создании избирательного блока "Явлинский - Болдырев - Лукин" ("Яблоко").
12 декабря 1993 г. был избран депутатом Государственной думы РФ I созыва, вошел в состав комитета по делам Содружества Независимых Государств и связям с соотечественниками, был членом фракции "Яблоко". Впоследствии, 17 декабря 1995 г. и 19 декабря 1999 г., избирался депутатом Госдумы II и III созывов от "Яблока", в 1995 - 2003 гг. занимал пост заместителя председателя думского комитета по вопросам местного самоуправления.
В 1995 г. вошел в состав бюро центрального совета объединения "Яблоко". В 2000 г. избран секретарем объединения по идеологии.
С 2004 г. по н. в. - глава московского регионального отделения партии "Яблоко", неоднократно переизбирался. В последний раз - 12 мая 2018 г. - на шестимесячный срок полномочий. Ранее срок составлял два года, но был сокращен по инициативе главы политкомитета и основателя партии Григория Явлинского, объявившего о необходимости обновления партийных кадров и избрания руководства отделения на переходный период до выборов мэра Москвы в сентябре 2018 г. Сам Митрохин заявил, что это будет его последним сроком на посту главы регионального отделения.
В июне 2004 г. избран председателем Комитета защиты москвичей, общественной организации, созданной для борьбы с нарушением жилищных прав горожан и незаконной застройкой столицы. Комитет был образован активистами партии "Яблоко" и представителями инициативных групп москвичей, при содействии уполномоченного по правам человека в РФ Владимира Лукина; исполнительным секретарем организации стал Алексей Навальный.
В 2004-2008 гг. - заместитель председателя Российской объединенной демократической партии "Яблоко" (до 2006 г. - Российская демократическая партия "Яблоко").
4 декабря 2005 г. Сергей Митрохин был избран в Московскую городскую думу по общему списку кандидатов "Яблока" и СПС. Возглавил фракцию "Яблоко – Объединенные демократы". Был членом комиссий Мосгордумы по безопасности, по городскому хозяйству и жилищной политике; по государственному строительству и местному самоуправлению; по организации работы думы; по перспективному развитию и градостроительству; по экологической политике; входил в состав бюджетно-финансовой комиссии.
На XV съезде "Яблока" 21-22 июня 2008 г. избран новым председателем партии, сменил на этом посту Григория Явлинского, отказавшегося от участия в выборах в пользу Митрохина. 16 июня 2012 г. Сергей Митрохин был переизбран председателем Российской объединенной демократической партии "Яблоко".
В 2013 г. выдвигался кандидатом от "Яблока" на выборах мэра Москвы. По итогам голосования 8 сентября того же года получил 3,51% голосов избирателей, занял 4-е место после Сергея Собянина, Алексея Навального и Ивана Мельникова.
На съезде Российской объединенной демократической партии "Яблоко" 19 декабря 2015 г. были приняты изменения в устав, запрещающие занимать пост председателя партии одному лицу более двух сроков. В результате Сергей Митрохин не смог принять участие в выборах председателя. На посту главы "Яблока" его сменила депутат заксобрания Карелии Эмилия Слабунова ("за" - 91 голос).
Женат, супруга Наталья. Имеет дочь 2002 г.р.